光合細菌菌種分離與保藏

隨著健康養殖漁業的發展，光合細菌越來越受到養殖者的青睞。光合細菌廣泛分布于生物圈的各個角落，在凈化水質、防治疾病和促生長方面效果明顯，可作為魚、蝦、貝的餌料、餌料添加劑及浮游動物餌料。光合細菌的培養首先要有菌種，菌種是從它生活環境中的微生物群中分離出來的。筆者現以水產養殖和水質凈化中常用的紅螺菌種為例，簡單介紹其分離和保藏技術，以供生產者參考。

菌種的分離

采樣 

紅螺菌種的種類在自然界中有有機污染的地方廣泛存在。樣品可以從河底、湖底、海底以及水田、池塘、溝渠等有污水進入的地方，以及食品工業污水排放處的橙黃色、粉紅色泥土中獲得。可以用杯子采集少量泥土，連水放入廣口瓶或用采水器、采泥器取樣。

為了獲得密度較高的樣品，也可以采取淡水池塘、池沼及海邊的污泥，置入廣口瓶中蓋緊，分別加入幾片海帶或其它一些海藻，裝滿淡水或海水，置入日光下培養。大約一個月以后，瓶底就可以見到光合細菌的沉淀物。經過這樣的簡單培養后，可以直接對此菌作分離后進行純培養。

富集 

富集培養時，將采集的樣品裝入玻璃圓筒或大型試管或具塞磨口玻璃瓶，再倒入配制好的培養液，充分攪拌。為造成厭氣環境，在玻璃瓶或試管中加入液體石蠟以隔絕空氣；磨口瓶只需將培養液加滿加塞，以排除其中空氣，瓶外再用塑料薄膜裹住扎牢，以減少水分蒸發。 培養溫度為5℃～35℃。光照可以利用陽光，夜晚時則利用人工光源，光照強度的適宜范圍為5000Lux～10000Lux。在這樣的培養條件下，大約經過2周～8周的培養，在玻璃瓶壁上會出現光合細菌的菌落，或者整個培養液長成紅色。如果是培養海水的光合細菌，因其生長緩慢，需要更長的富集培養時間。 

富集操作可以重復進行，方法是將初步富集的光合細菌的菌液或泥土移入磨口玻璃瓶中繼續培養，反復多次，光合細菌占絕對優勢時可確認富集成功。

為了避免在培養液中藻類和綠桿菌科的細菌的發展，可采用濾光片，使波長800納米或更長波長的光透過，這樣可以更有效地達到富集紫色非硫細菌的目的。另外，采用含有氯化物的培養基效果比采用硫酸鹽培養基好，可以阻礙紫色硫細菌生長。

分離 

一旦富集培養成功，就可以緊接著進行分離培養。以紫色非硫細菌為例，其生長速度較快，大約在一周左右移植比較合適。若是海水生長的紫色非硫細菌則生長緩慢，約需3周。移植時先配制固體培養基，滅菌后澆成平板。將菌液做適當稀釋后，用劃線法或涂布法進行接種，然后置入厭氣缸等容器中在厭氣、光照條件下培養。在溫度25℃～35℃，光照2000Lux～3000Lux的條件下培養2天～3天至7天左右，就能長出光合細菌菌落。仔細挑取單菌落，繼續分離培養，反復多次，便能得到紫色非硫光合細菌的純培養物。

在富集培養和分離培養時，不同的種類可以根據其不同的生態要求選擇不同的培養條件。如莢膜紅假單胞菌的純分離，可在分離紫色非硫細菌所用的培養基中加入0.15%的丙酸鈉，在光照條件下進行厭氣培養，反復數次，以達到富集的目的。此外，把碳源基質改成葡萄糖，以0.1%～0.3%的量加入培養基中，經過反復幾次培養，培養物中的莢膜紅假單胞菌一般會占絕對優勢。但其中厭氣的異養細菌的生長可能也受到促進，所以有必要再一次以丙酸鈉作為基質，進行分離培養。紅螺菌屬的種類可利用紅螺菌屬細菌具有快速運動能力的特點來分離，最后通過鑒定加以確證。

菌種保藏

紫色非硫細菌的純培養物，可以保持在不同的培養基上，但一般使用分離時的培養基，或根據分離菌株的特殊要求而另行配制。

將分離后的菌株的純培養物，穿刺接種于裝有其所需的固體培養基的試管內，置于厭氧缸中，在光照的條件下進行培養，待長好后取出，在試管中加入無菌的液體石蠟，以隔斷空氣，便可保存較長時間。也可以將保存用的菌株試管，放入大型試管中，在其底部加吸氧劑，大試管用塞子塞緊并抽氣減壓進行培養。在此條件下，大約1年中移植1次，可保存具有強活力的菌株。

（作者：張文革）